بررسی مقایسه ای بیماریزایی پاساژهای متوالی نئوسپورا کنینوم در رده های مختلف سلولی با استفاده از روشهای هیستوپاتولوژیک، ایمنوهیستوشیمی و مولکولی

نئوسپورا کنینوم یک تک یاخته داخل سلولی اجباری و عامل بیماری زای مهم در گاو و سگ به شمار می رود. با توجه به طبیعت داخل سلولی انگل و درگیری سیستم ایمنی سلولی، پاسخ های ایمنی حاصل نقش مهمی جهت محافظت در برابر انگل دارند. با توجه به این نکات و عدم وجود داروی مناسب علیه این بیماری، روشهای کنترل عفونت نئوسپورا کنینوم، به طرف تولید واکسن های موثر سوق یافته است. یکی از روشهای مهم تولید واکسن برعلیه تک یاخته ها تخفیف حدت انگل زنده می باشد. مطالعات قبلی نشان داده است که انجام پاساژهای متوالی در شرایط آزمایشگاهی باعث تخفیف حدت تک یاخته نئوسپورا می شود. آنچه در این پژوهش مورد توجه قرار گرفته است این است که آیا علاوه برتعداد پاساژ در محیط کشت سلولی، نوع سلول میزبان نیز در کاهش حدت نئوسپورا موثر است یا خیر. امروزه به طور گسترده ای از کشت سلولی به منظور جداسازی و تکثیر نئوسپورا کنینوم برای اهداف مختلفی استفاده می شود. در اکثر مطالعات، سلول vero به عنوان بهترین سلول برای جداسازی و تکثیر نئوسپورا معرفی شده است. در این مطالعه، در مرحله اول، به منظور ارزیابی حساسیت سل لاین های مختلف به این انگل و توان تکثیر این تک یاخته در این سل لاین ها، تکی زوئیت های انگل به منظور آداپته سازی به رده های سلولی: vero (سلول اپیتلیال با منشا کلیه میمون سبز آفریقایی)، tli (لنفوسیت ترانسفورم شده با تیلریا)، j774 (سلول های شبه ماکروفاژ بافت هماتوپوئتیک موش balb/c)، ma-104 (سلول اپیتلیال بافت کلیه میمون سبز آفریقایی)، sw742 (سلول سرطانی اپیتلیال روده انسان)، mdck (سلول اپیتلیال بافت کلیه سگ)، mccoy (سلول فیبروبلاست مایع مفصلی موش) افزوده شد و پس از دو هفته آداپته سازی، میزان یکسانی از تکی زوئیت در مجاورت میزان یکسانی از هر کدام از رده های سلولی نامبرده قرار گرفت و تا زمان ایجاد cpe کامل در همه سلول ها، روزانه (به مدت چهار روز)، تکی زوئیت های رها شده از هر سل لاین پس از سانتریفیوژ، شمارش شدند. در نهایت با مقایسه میزان تکی زوئیت های رها شده از سل لاین های مختلف، یک سل لاین با توان تکثیر بیشتر و یک سل لاین با توان تکثیر کمتر نسبت به سل لاین vero و همچنین سل لاین vero به عنوان مبنا، انتخاب و تکی زوئیت های نئوسپورا کنینوم، در شرایط یکسان بر روی سه سل لاین منتخب به مدت سه ماه به صورت متوالی پاساژ داده شدند. به منظور بررسی و مقایسه میزان حدت تکی زوئیت های به دست آمده از سه سل لاین مختلف، دوزهای مختلف تکی زوئیت به دست آمده از سلول لاین های فوق (5000، 10000 و 15000 تکی زوئیت در هر میکرولیتر)، به تخم مرغ جنین دار 9 روزه نژاد لوهمن تزریق شد و روزانه میزان مرگ و میر در هر گروه ثبت و از بافتهای مغز، قلب و کبد آنها جهت مطالعات هیستوپاتولوژی و مولکولی نمونه برداری انجام شد. تعداد تکی زوئیت های رها شده از سل لاین های مختلف به کار برده شده در این مطالعه، حساسیت خوبی را در سل لاین های vero, j774, tli, ma-104, sw742 نشان داد؛ در حالیکه سل لاین های mdckو mccoy حساسیت و توان تکثیر ضعیفی برای نئوسپورا از خود نشان دادند. با توجه به نتایج به دست آمده در این مرحله، سل لاین tli به عنوان سل لاین با توان تکثیر کمتر و j774 به عنوان سل لاین با توان تکثیر بیشتر نسبت به سل لاین vero به منظور سه ماه کشت متوالی انتخاب شدند. نتایج میزان تلفات در جنین های تخم مرغ، تلفات 100% در تخم مرغ های تلقیح شده به وسیله دوز های مختلف تکی زوئیت های به دست آمده از سل لاین های vero, tli را نشان داد؛ در حالیکه در تخم مرغ های تلقیح شده به وسیله دوز های مختلف تکی زوئیت های به دست آمده از سل لاین j774، تلفات 10% مشاهده شد. نتایج حاضر نشان می دهد که میزان تلفات در گروه های مختلف آزمایش، وابسته به دوز تلقیح شده بوده؛ بدین صورت که در دوز های بالاتر، مرگ و میر زودتر مشاهده شد. نتایج بررسی ضایعات پاتولوژیک در بافت های مورد آزمایش شامل هپاتیت، میوکاردیت و آرتریت غیرچرکی تک هسته ای بود. در رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمی در اکثر موارد آنتی ژن های نئوسپورا کنینوم در سیتوپلاسم سلول های بافت همبند و اندوتلیوم عروق مشاهده شد. در مطالعه حاضر آزمایشات مولکولی نسبت به ایمنوهیستوشیمی، میزان حساسیت بیشتری را در تشخیص حضور آنتی ژن نئوسپورا کنینوم در بافت ها، بخصوص بافت مغز نشان داد. به این صورت که در هیچکدام از گروه های مورد آزمایش، در مقاطع تهیه شده با رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین از بافت مغز، اثری از آماس مشاهده نشد و در مقاطع تهیه شده با رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمی میزان آنتی ژن، کم تا متوسط بود و نتایج pcr حضور باند های واضحی از ژنوم نئوسپورا کنینوم با 328 جفت باز را نشان داد. به طور خلاصه مهمترین دستاورد های این مطالعه به شرح زیر می باشد: 1- برای اولین بار سل لاینی معرفی شده است که از سل لاین vero (که در دنیا به عنوان بهترین سل لاین جهت کشت نئوسپورا کنینوم مطرح می باشد) تکی زوئیت های آزاد بسیار بیشتری تولید می کند. 2- اولین سل لاین معلق جهت کشت موفق نئوسپورا کنینوم در این مطالعه ارائه شده است. 3- در این مطالعه برای اولین بار اثبات گردید که علاوه بر تعداد پاساژ، نوع سل لاین نیز در تغییر حدت تک یاخته نئوسپورا کنینوم تأثیر دارد. 4- بر اساس نتایج مطالعه حاضر، کشت نئوسپورا کنینوم بر روی سل لاین j774 باعث کاهش بارز حدت این تک یاخته می گردد و لذا دیگر نیازی به استفاده از روش هایی مانند موتاسیون، اشعه گاما و کلون های اختصاصی برای تخفیف حدت انگل نمی باشد. 5- کشت معلق نئوسپورا کنینوم بر روی سل لاین j774 باعث کاهش چشم گیر هزینه و زمان در تولید واکسن می گردد.